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导读糖尿病肾病细胞模型三羧酸循环代谢异常和机制初探本实验采用PA体外刺激人肾小管上皮细胞(HK-2)的方法,探讨由DN造成的代谢异常,找寻可能的指示物并为早期诊断DN提供研究基础。
【基础研究】糖尿病肾病细胞模型三羧酸循环代谢异常和机制初探
121111中国药科大学药科院药物代谢动力学重点实验室,南京 210046,江苏;
2南京中医药大学药学院药效与安全性评价重点实验室,南京 210023,江苏
江苏省科技计划项目临床医学科技专项 (BL2014070);国家自然科学基金项目 (81072692);973 “国家重点基础研究发展计划资助”子课题 (2012CB517606)
俞晓忆,男,博士研究生,研究方向:药物代谢动力学。
Tel: 13675138271
E-mail:yxyeventually@hotmail.com
王广基,通信作者,男,博士,工程院院士,研究方向:药物代谢动力学。
摘要目的:探讨糖尿病肾病(DN)状态下三羧酸(TCA)循环中间代谢产物的差异,观察糖尿病肾病细胞模型中的代谢紊乱。方法:体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),分为对照组(control)、高糖组(high glucose)、棕榈酸组(PA)、棕榈酸复合高糖组(PA high glucose)。线粒体染色法观察造模后的细胞损伤状况,基于气相的代谢组学方法检测细胞模型中出现的代谢差异,并找出相关差异化合物。气象色谱-质谱(GC-MS)定量方法进一步测定差异化合物的绝对浓度。qPCR测定差异化合物相关通路的酶表达。结果:12 h,24 h内高糖对HK-2细胞的损伤和代谢影响较弱,而棕榈酸在短期内就可以造成肾脏细胞损伤和代谢紊乱,复合因素下的诱导效果更甚。造模细胞内出现的代谢异常中TCA循环占主要部分,其中柠檬酸和琥珀酸水平出现异常升高。并且琥珀酸水平异常主要由其合成酶影响导致。结论:棕榈酸诱导引起细胞中TCA循环代谢异常变化可能与DN相关。
关键词糖尿病肾病;HK-2;棕榈酸;琥珀酸
糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)已经成为了糖尿病患者最主要的死亡原因之一,也是导致终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。DN预后极差且一旦发生致死率极高[1-3]。中医理论认为糖尿病肾病本源来自于虚,虚和淤贯穿其始终[4-5]。而西方发现DN在临床上会出现比较明显的肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)降低,以及白蛋白尿的升高[6]。在各种类型的肾脏疾病中,出现蛋白尿的临床现象被认为是晚期肾病的主要原因,并被认为是危及生命的疾病[1-3, 7]。因此相对其他症状,治愈蛋白尿成为了治疗蛋白尿类肾病的主要目标。但是临床上GFR的测定较为繁琐,且白蛋白尿的预测准确率不高,虽然在最新的临床研究中,某些免疫抑制剂或抗高血压药被发现可以有效的降低蛋白尿[2, 8-10],但也很难延长肾病患者健康寿命及改善患者预后。所以为了防治DN的高发,对DN早期标志物的发现与病理机制的探究显得尤为必要。在DN中蛋白尿的增加会损伤近曲小管细胞,导致严重的肾小管间质病变和随后引发的肾功能不全[1, 7]。因此减少肾小管细胞在蛋白尿状态下的细胞毒性是DN蛋白尿药物研制的目标。研究发现,肥胖也是蛋白尿的病因之一,同时是肾小球损伤以及病人肾功能快速下降的主要原因[11-13]。肥胖会加剧蛋白尿诱导的肾小管间质病变[14-15],并且蛋白尿诱导的肾小管间质病变和肾脏最终的病变程度直接相关。在肥胖人群中,脂肪酸水平与反映肥胖的指数BMI等呈现显著正相关[16-17],且游离脂肪酸可以作为脂毒性介导的氧化应激导致肾小管的严重间质损害,特别在肥胖相关的疾病和DN[18-21]。所以高脂肪酸与DN有着紧密的联系。近期研究表明脂肪酸诱导的近曲小管损伤的分子模型可以用来研究DN的分子机制,棕榈酸(palmitic acid, PA)这种脂肪酸是胰岛素活性的负调节剂,它可以抑制因胰岛素刺激而引发的 Akt ser473磷酸化,所以PA可以作为诱导肾脏损伤的诱导剂[22-23]在本实验中我们运用了棕榈酸诱导DN的体外模型,但由于DN除了肾脏损伤机体细胞同时也会处于高糖的状态,所以实验附加高糖等其他因素以观察DN状态下的异常代谢方式,以及相关酶的变化趋势。本实验采用PA体外刺激人肾小管上皮细胞(HK-2)的方法,探讨由DN造成的代谢异常,找寻可能的指示物并为早期诊断DN提供研究基础。
材料与方法1.1实验材料人肾小管上皮细胞(HK-2),购自于武汉细胞库;DF12培养基(DMEM和F12两种培养基1:1混合,Gibco);10%胎牛血清(FBS,Hyclone,Utah, USA);青霉素、链霉素均购自于南京生兴生物工程公司;1,2-13C2-肉寇酸(稳定的同位素内标, Sigma-Aldrich);吡啶 (Sigma-Aldrich),MSTFA含1% TMCS (MSTFA,N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺,Sigma-Aldrich);甲醇、正庚烷 (Sigma-Aldrich);超纯水 (自制,Millipore,美国);棕榈酸、琥珀酸、葡萄糖 (Sigma-Aldrich);盐酸 (Sigma-Aldrich);mito-Tracker Green (线粒体绿色荧光探针) 50 μg购置于碧云天。
1.2实验仪器 SHIMADZU QP2010Ultra/SE GC-MS系统装配化学结合 Rxi-5MSd的30 m×0.25 mm弹性石英毛细管柱 (AOC-20S自动进样系统),Sovall Biofuge Stratos高速冷冻离心机;Thermo分体式真空离心浓缩挥干仪 ( Se250EXP, RVT400, OFP400) Bio-Tek Synergy H1多功能荧光酶标仪;Sovall Biofuge Stratos高速冷冻离心机;定量PCR仪( Thermal Cycler DiceTM Real Time System,Takara,Japan);XW-80A台式涡旋振荡器; Minispin小型高速离心机 (德国Eppendorf公司);Thermo Savant SPD 2010离心浓缩装置 (Thermo Co,MA,USA);Milli-Q Gradient A10超纯水机 (Millipore Inc. USA);HL-2恒温水浴;Thermo IEC低温高速离心机 (Thermo CO, MA, USA), Leica DMI3000B (Germany)莱卡荧光倒置显微镜。
1.3实验方法
1.3.1造模培养基的的配制 高糖诱导模型培养基:普通培养基的含糖量为4.5 mg/mL,为了模拟高糖的病理状态,我们将含糖量补足到8 mg/mL。
PA诱导模型培养基:(1)配置PA的NaOH溶液:PA 38.463 mg,NaOH 6 mg,溶于1.5 mL超纯水中,70 °C,反应1 h;(2)配置 PA的牛血清白蛋白(BSA)溶液:将PA的NaOH溶液趁热加入28.5 mL 5%BSA溶液,1:20稀释,并迅速放入 60 °C水浴以防止析出;(3)配置含PA的培养基:将PA的BSA溶液加入120 mL不含血清的DF12培养基中,以1:5的比例稀释。
PA和高糖复合模型培养基:在 PA培养基的基础上补充糖量至8 mg/mL。
1.3.2形态学观察及线粒体染色取对数生长期细胞,105的密度点6孔板,用含血清的正常培养基培养细胞,待细胞长到80%后弃去培养基,换为无血清培养基饥饿24 h后,换成造模溶液,37 °C含5% CO2环境培养。12 h、24 h以后弃去培养基,加入1 mL的Hank's溶液轻微荡洗两次,然后将Mito-Tracker Green按1:1 000-1:50 000比例加入Hank's溶液作为工作液,每孔加入1 mL工作液。37 °C温孵箱温孵30~45 min后,弃去工作液,加入预先由37 °C温孵过的Hank's溶液后在显微镜下观察。观察分为明场和荧光两次,且必须保证两次观察视野固定。
1.3.3细胞代谢组学测定取对数生长期细胞,以105的密度点6孔板,用含血清的正常培养基培养,待细胞长到80%后弃去培养基,换为无血清培养基饥饿。24 h后换成含造模溶液的培养基,分别培养12 h、24 h后弃去培养基,将6孔板置于-20 °C保存。需要测定时取出细胞板,每孔加入300 μL超纯水,冻融3次。最后将已融化的细胞液轻轻刮下,放置于1.5 mL EP管中。取20 μL于另一个1.5 mL EP管中用来定蛋白,剩余的280 μL细胞液加入840 μL的甲醇(3倍体积,含内标同位素肉蔻酸),于涡旋振荡器上震荡5 min,4 °C冰箱静置1 h,20 000 g高速离心10 min。取400 μL上清于GC小瓶中,45 °C真空挥干3 h,向干了的小瓶中加入30 μL的甲氧胺吡啶(现配现用,10 μg/mL),涡旋3 min后,常温静置肟化16 h。在样品中再加入30 μL的MSTFA(1%TMCS作为催化剂),涡旋3 min,衍生化(三甲基硅烷化)反应1 h,最后向小瓶中加入30 μL甲基肉蔻酸(15 μg/mL),震荡1 min后静置待测。1.3.4 qPCR法检测细胞内相关酶的表达细胞培养方式同“1.3.3”。用PBS溶液洗涤两次后加入RNAiso溶液吹打细胞直至完全。吸取含细胞的裂解液至EP管中,加入20%的氯仿,上下颠倒20次,充分乳化后室温静置5 min。4 °C ,12 000 g离心15 min,吸取450 μL上清液加入等量的异丙醇,上下颠倒20次,常温静置10 min。4 °C ,12 000 g离心10 min,倾倒上层异丙醇溶液,保留白色沉淀。加入1 mL 75%的乙醇(DEPC水配置)清洗沉淀。4 °C,12 000 g离心5 min后加入10 μL DEPC水溶解沉淀。逆转录成为cDNA,并进行扩增反应,最后通过目标基因和参照基因的Ct值计算出目标基因的相对表达量。
1.3.5数据处理实验结果由SPSS18.0进行分析。代谢组学数据首先运用相似度搜寻方式对比未知化合物质谱图和已知库内的质谱图(NIST08, Wiley),对色谱中各个时间化合物进行鉴定,鉴定后根据各个化合物的质荷比对各个化合物峰进行积分。得到的积分数据运用内标外标矫正,再运用蛋白量矫正。所得积分数值通过Simca-P13.0进行分析,并用metabo-analysis网络工具进行分析。组间方差齐性采用t检验。
2结果2.1造模后肾小管上皮细胞的影响 荧光显微镜下观察到对照组细胞状态正常,没有出现受损状况,细胞边界清晰,线粒体染色后观察到细胞亚细胞器完整结构正常且边界清晰。高糖组细胞轻微受损,线粒体染色后发现,正常状态的细胞数量较正常组有所减少。PA组细胞损伤现象非常明显,明场下观察到贴壁细胞数量明显减少,细胞边缘模糊,染色后发现细胞受损严重,线粒体损伤。PA复合高糖组,细胞损伤亦十分明显,染色后发现对照组细胞的数量较PA组更少,细胞边缘模糊且细胞形态发生改变,线粒体结构出现明显的损坏。见Fig.1。
0H2Td0PfZ8
2.2 PA对肾小管上皮细胞的代谢扰动运用已建立的气相代谢组学方法进行代谢组测定(典型色谱图见Fig.2,鉴定出69种已知化合物)。分析发现在12 h和24 h,对照组样本点距离较近,说明对照组代谢一直保持正常水平,高糖组样本点距离对照组不远,表明高糖诱导的细胞并未出现明显的代谢差异;而PA组后样本点与对照组距离较远,表明PA诱导的细胞后出现明显的代谢差异,复合因素诱导差异更大,见Fig.3。代谢组学分析表明在12 h和24 h PA组细胞都较对照组出现了明显的代谢差异,见Fig.4。
0H2Td0b9aw
0H2Td0R27a
0H2Td0Oli3
2.3代谢通路异常与差异化合物详细分析各组间差异化合物,发现三羧酸(TCA)循环、氨基酸、部分脂质代谢通路出现代谢差异。其中TCA循环的差异占代谢差异的主要部分,表现为TCA循环出现在代谢通路图(Fig.5)的右上角且在代谢通路分析棒图(Fig.5)的上半侧。提示TCA循环紊乱可能是PA诱导的肾脏细胞出现代谢异常的主要原因。于是我们对TCA循环中间物质进行代谢组学半定量分析,发现12 h时高糖组琥珀酸峰面积明显增加(P<0.05),而PA组时琥珀酸峰面积显著增加(P<0.01),复合因素组的影响较PA组更为明显(P<0.01);在24 h时高糖组琥珀酸水平明显降低(P<0.05),而PA组和复合因素组诱导出现了显著的降低趋势(P<0.01),见Fig.6。同时我们发现12 h高糖条件下并不能诱导柠檬酸峰面积增加,而PA可以诱导柠檬酸显著增加(P<0.01),复合因素诱导下的柠檬酸增加现象更为明显(P<0.01);在24 h时,PA和复合因素诱导下柠檬酸水平均显著下降(P<0.01)。
0H2Td0fkxb
0H2Td0YGDd
2.4造模细胞柠檬酸琥珀酸定量分析基于半定量结果,我们运用相关标准品对柠檬酸和琥珀酸进行了精确的定量。定量结果显示高糖并不能诱导琥珀酸及柠檬酸水平的积聚,而PA在12 h可以造成琥珀酸水平升高(P<0.05)和柠檬酸水平升高(P<0.01)。12 h时复合因素诱导也可以导致琥珀酸水平显著升高(P<0.01)和柠檬酸水平显著升高(P<0.01)。而24 h时PA诱导的HK-2细胞内琥珀酸和柠檬酸出现显著下降(P<0.01)。见Fig.7。
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2.5 TCA循环相关酶表达测定 我们测定了模型细胞中丙酮酸脱氢酶(PDHA)和谷氨酸脱氢酶(GLUD)的表达,发现在PA和复合因素诱导下,12、24 h PDHA及GLUD(P<0.05)的表达均上调,见Fig.8。
0H2Td0ZgBJ
琥珀酸上游合成酶succinate-CoA ligase的三种亚型中,高糖上调SUCLG1(P<0.05)而对其他两种亚型的上调不明显。而PA尤其是复合因素诱导下,在12 h可以明显上调琥珀酸上游合成酶的表达(P<0.05, P<0.01)。在24 h,琥珀酸上游合成酶表达出现明显下调(P<0.05, P<0.01)。而在高糖、PA以及复合因素诱导下琥珀酸下游分解酶琥珀酸脱氢酶(SDH)的表达均无明显变化,见Fig 9。
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讨论DN作为糖尿病的主要并发症之一,一旦发现极难治疗,且预后极差。早期研究表明DN的病变起始于肾小球损伤,但近期研究发现肾小管细胞损伤作为糖尿病肾病的病因,其优先程度逐渐增加,甚至超过肾小球损伤,同时也是糖尿病患者后期出现终末期肾病(ERSD)的重要原因,所以肾小管损伤也逐渐成为了治疗糖尿病肾病的研究切入点[24-26]。
在前期实验中,我们发现DN模型小鼠血液和尿液中棕榈酸水平升高,同时文献表明棕榈酸作为一种重要的脂肪酸,常被用于DN及胰岛素抵抗模型[22-23]。所以我们采用高糖与棕榈酸诱导肾小管上皮细胞(HK-2)模拟体外DN环境,探究DN状态下的代谢差异以及可能的机制。
DN状态下的肾脏细胞处于高糖环境,故高糖培养基常被运用于建立DN细胞模型[27]。本实验发现高糖单因素诱导肾脏细胞损伤在短时间内效果不明显,而棕榈酸诱导肾细胞在短期内就出现了明显的损伤,棕榈酸诱导的肾细胞在附加高糖的情况下造成的损伤与棕榈酸类似。说明肾脏模型细胞在短期内出现的损伤可能主要源自于棕榈酸而非高糖。
代谢组学作为一个新兴的“组学”科学中的一员,可以对大量内源性化合物同时测定,越来越广泛的运用于生命科学研究、代谢性疾病研究及临床生物标注物找寻[28-30]。我们应用前期建立的基于GC-MS的代谢组学方法对棕榈酸诱导的DN细胞进行研究,实验发现,高糖诱导的肾脏细胞出现轻微代谢差异,棕榈酸诱导与复合因素诱导情况下出现更加明显的代谢差异,提示在短时间内高糖诱导后的肾脏细胞无法出现明显的代谢紊乱,而棕榈酸在短期就可以诱导肾脏细胞出现代谢差异。对棕榈酸诱导情况下的代谢差异化合物进行分析,发现三羧酸循环、氨基酸代谢及部分脂肪酸代谢通路均出现紊乱,这与部分报道相符。其中TCA循环代谢异常最为明显。半定量结果显示琥珀酸和柠檬酸水平都表现为早期升高,而随时间的增加复又降低。此现象又经定量方法证实。提示TCA循环代谢紊乱可能与DN有着较为紧密的联系。
TCA循环的代谢紊乱在很多疾病中也会出现,但是原因大多不一样[31-33]。TCA循环中的NAD+、琥珀酸、柠檬酸都被证实可以影响机体免疫[34-39]。前期研究中,我们也发现在DN小鼠体内出现早期的柠檬酸和琥珀酸等TCA中间产物蓄积现象。提示TCA循环紊乱可能与DN的发生发展过程密切相关,并可能通过造成炎症和影响机体免疫加重病情[40]。本实验结果表明,一般情况下琥珀酸水平是由琥珀酸上游合成酶和下游分解酶决定。本实验结果表明,高棕榈酸诱导的肾脏细胞出现的琥珀酸升高可能是由于琥珀酸合成酶succinate-CoA ligase上调而分解酶SDH的不明显变化导致,且琥珀酸上游合成酶的表达趋势为先上升后下降及琥珀酸分解酶无明显变化,这些与琥珀酸物质水平变化基本一致。且在生理情况下,TCA循环中间产物是由丙酮酸在丙酮酸脱氢酶(PDHA)催化下转化为的乙酰辅酶A和谷氨酸在谷氨酸脱氢酶(GLUD)催化下转化为的α-酮戊二酸经转化提供[41-42]。在棕榈酸诱导的肾脏细胞中PDHA和GLUD上调,可能造成TCA循环中间产物增多。综上所述,TCA循环尤其是其中的琥珀酸可能与DN有密切的关系,可能对DN的防治有重要意义,其他的机制有待于进一步研究。
参考文献略
中国临床药理学与治疗学》杂志转载请标明出处!
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